Protocolo completo para el modelo de hipertensión inducida por Ang II en ratones C57BL/6

Protocolo completo para el modelo de hipertensión inducida por Ang II en ratones C57BL/6

Título: abordar los principales desafíos en Ang II inducida hipertensión modelado: una solución completa de la implantación de precisión A la monitorización dinámica

introducción

La hipertensión y sus complicaciones representan un desafío para la salud mundial. El modelo de hipertensión inducida por la angiotensina II (Ang II), un modelo preclínico fundamental para estudiar el sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS) y otros fármacos diana relacionados, es fundamental para el éxito de la investigación. Sin embargo, problemas como una tasa de fracaso superior al 50%, baja supervivencia postoper, y datos erráticos de presión arterial son comunes. Las causas raíces a menudo se encuentran en los detalles pasados por alto de la precisión de la liberación de fármacos y el trauma quirúrgico. Este artículo proporciona un protocolo detallado, altamente reproducible para el establecimiento de un modelo de hipertensión inducida por Ang II en ratones C57BL/6, abordando directamente estos puntos de dolor para mejorar su éxito experimental.

I. antecedentes

La angiotensina II (Ang II) es un potente vasoconstricdentro del RAAS. La exposición crónica a altas concentraciones de Ang II puede desencaden una serie de cambios fisiopatológicos, incluyendo pero no limitado a: hipertensión, remodelcardiaca y vascular, estrés oxidativo, respuestas inflamatorias, disfunción endotelial, y lesión renal. Por lo tanto, la infusión subcutánea continua de Ang II para establecer un modelo animal hipertense se ha convertido en un método clásico en la investigación cardiovascular.

II. Preparación Experimental

Animales: ratones machos C57BL/6, grado SPF, 8-10 semanas de edad, peso 25-30g. Aclimatarse durante al menos una semana antes de los procedimientos.

Reactivos: angiotensina II (Ang II), solución salina, isoflurano, povidona yodo, etanol al 75%, crema depilatoria.

Equipo y consumibles:

Equipamiento: máquina de anestesia Animal con cámara de induc, almohadtérmica hometérmica, plataforma quirúrgica, esterilizador de instrumentos, fuente de luz fría, sistema no invasivo de presión arterial del puño de la cola.

Consumibles: bomba osmótica Alzet (modelo 2004W o equivalente, tasa 0,25 ® L/h, duración 28 días), instrumentos quirúrfinos (tijeras, pinzas, hemostat), Clips de herida/aplicador, cortde pelo, filtro estéril 0,22 μm, jeringas estéri.

III. Procedimiento Experimental detallado

Paso 1: aclimatación y medición de línea base (¡Crucial!)

Objetivo: minimizar el estrés durante la medición de la pa y obtener datos de referencia confiables.

Procedimiento: durante al menos 5-7 días antes de la cirugía, manejar ratones diariamente y aclimatarlos a la inmovilización del manguito de cola. Medir y registrar la presión arterial sistólica (pas) estable durante al menos 3 días consecutivos como línea base.

Paso 2: preparación precisa del fármaco (clave del éxito)

Vehículo: para mantener la estabilidad de Ang II, utilice 0.01N acido-salino acético (pH ≥ 5.0) como vehículo. Añadir 0,57 mL de ácido acético glacial (17,5 M) a 1L de solución salina y mezclar. La solución salina sola puede servir como un control.

Cálculo de la concentración del fármaco (dosis: 750 ng/kg/min, Pump: 2004W):

Principio: calcular basándose en el peso corporal máximo en la cohorexperimental para asegurar una dosis suficiente para todos los individuos.

Conocida: 2004W velocidad de bomba − 0.25 ≈ L/h, volumen de bomba − 200 μL, duración 28 días.

Cálculo:

Ang II Total requerido por hora por ratón = peso corporal máximo (kg) × 750 (ng/kg/min) × 60 (min)

Concentración de reserva de Ang II = Total por hora (ng)/velocidad de bomba (0.25 μL/h)

Ang II Total requerido = concentración de reserva (ng/ − L) → volumen de la bomba (− L) → número de ratones (n)

Ejemplo: para un peso máximo de 30g (0,03 kg), Ang II por hora = 0,03 × 750 × 60 = 1350 ng. Concentración requerida = 1350 ng/ 0,25 − L/h = 5400 ng/ − L = 5,4 μg/ − L. Total fármaco (para 10 ratones) ≥ 5,4 g/ − L − 200 L − 10 = 10,8 mg.

Preparación: filtrar la solución preparada de Ang II a través de un filtro estéril 0,22 μm, aliquot, y almacenar a -20°C.

Paso 3: llenado y cebado de la bomba (Control de precisión)

Pesar la bomba vacía: registre el peso inicial de la bomba vacía (con moderador de flujo) (W1).

Llenado aséptico: inyeclentamente la solución del medicamento en la bomba a través del oride llenado usando una jeringa estéril hasta que aparezca una gota en la salida, asegurando que no haya burbujas de aire.

Pesar la bomba llena: pesarla de nuevo (W2). El volumen de llenado (W2 - W1) debe ser > 90% del volumen nominal de la bomba. Si no, vaciar y rellenar.

Activación In Vitro (Priming): para garantizar una liberación inmediata y estable después de la implantación, sumergir la bomba llena en solución salina estéril a 37°C e incubar durante 40-48 horas (para el modelo 2004W). Este paso mejora significativamente la estabilidad de entrega inicial.

Paso 4: cirugía de implantación subcutánea (técnica mínimamente invasiva)

Anestesia y preparación: anestesiar al ratón con isoflurano. Afeitar la piel entre las escápulas y desinfecla la piel alternativamente con yodo y alcohol.

Incisión y disección directa: hacer una incisión transversal de la piel de ~1 cm alo largo de la línea media entre las escápulas. Utilice pinzas para crear cuidadosamente un bolsillo subcutánea hacia el animal#39; Cuartos traseros s, lo suficientemente grandes como para sostener la bomba.

Implantación de la bomba: inserte la bomba en el bolsillo con el portal de suministro mirando hacia la cola (lejos de la incisión).

Cierre: cierre la incisión de la piel usando clips para la herida o suturas. Vuelva a desinfectar el área alrededor de la incisión.

Paso 5: cuidados postoper: las 72 horas críticas (mejorar la supervivencia)

Calor: coloque al ratón solo en una jaula con ropa de cama limpia en una almohadtérmica de 37°C o bajo una lámpara de calor hasta que esté completamente despierto y móvil.

Cuidados médicos de apoyo: administrar solución salina precalentpor vía subcutánea (por ejemplo, 0,5 — 1 mL) si es necesario para prevenir la deshidratación. Considerar analgésicos (por ejemplo, buprenorfina) para el alivio del dolor postoper.

Monitoreo: monitorear de cerca el mouse' Comportamiento, ingesta de alimentos/agua y cicatride heridas durante al menos 3 días.

Paso 6: monitoreo de la presión arterial y recolección de datos

Tiempo: medir la presión arterial de 2 a 3 veces por semana después de la cirugía.

Ambiente: las mediciones deben realizarse en un lugar tranquilo, cálido (~30°C), con poca iluminación. Precalentar el ratón en una jaula de restricción bajo una lámpara de calor durante 15-20 minutos para dilatar las arterias de la cola.

Medición: registre 10-15 valores válidos consecutivamente, descarte valores atípicos y registre el promedio. Realizar mediciones a la misma hora todos los días (por ejemplo, por la mañana) para minimizar la variación diurna.

IV. Validación del modelo y resultados esperados

Presión arterial: el modelado exitoso típicamente resulta en un aumento significativo de la pas dentro de 3-7 días, alcanzando una meseta alrededor de la semana 2, con una elevación de 20-60 mmHg por encima de la línea de base.

Análisis del punto final (opcional):

Peso de los órganos: en la terminación, recoger los órganos (corazón, aorta, riñones). Calcular el peso del órgano/longitud de la tibia o proporciones de peso corporal. Los hallazgos esperados incluyen hipertrofia cardíaca.

Histología: H&E tinción, Masson' El tricromo s, etc., puede revelar patología como hipertrofia de cardiomiocitos, engrosde la pared vascular y depósito de colágeno (fibrosis).

Biología Molecular: la regulación de los genes relacionados con la hipertrofia, fibrosis e inflamación (por ejemplo, ANP, BNP, colágeno I/III, TNF- -) se puede detectar en el corazón, los vasos y los tejidos renales.

conclusión

Al adherir estrictamente a este protocolo, con énfasis particular en la formulación precisa del fármaco, el cebado adecuado de la bomba, la cirugía mínimamente invasiva meticul, y el cuidado postoperminucioso, los investigadores pueden superar eficazmente los desafíos principales de la reproducibilidad pobre y las bajas tasas de supervivencia en el modelado de la hipertensión inducida por Ang II, estableciendo así una base de modelo animal estable y fiable para la investigación cardiovascular.

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